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研发了疫苗、病原检测和免疫增强剂技术并进行
分类:养殖

获奖成果名称:南海主要海水养殖鱼类免疫机制及其在免疫防治中的应用 获奖名称及等级:2014年度广东省科学技术奖励二等奖 主要完成单位:中国水产科学研究院南海水产研究所 主要完成人:冯娟,邱丽华,郭志勋,苏友禄,徐力文,王瑞旋,林黑着,王江勇,郭奕惠,刘广锋,姜敬哲 成果简介: 海水鱼的养殖是水产养殖的重要组成部分,为解决养殖过程中的病害问题,项目从鱼及病原入手,通过对鱼免疫系统和病原的研究,研发了疫苗、病原检测和免疫增强剂技术并进行了集成,有效预防疾病的发生。其主要研究成果有:①首次从环境胁迫、免疫发育、免疫分子应答三个层次对军曹鱼和海鲈的免疫系统进行了解析,填补了南方两种重要海水经济鱼类在免疫研究方面的空白。②首次在国内制备了病原菌的LPS亚单位疫苗,并制备了1种神经坏死病毒的重组MCP基因工程疫苗,其中LPS疫苗获得了国家发明专利授权。③首次分离得到了军曹鱼和卵形鲳鲹的5种细菌性病原菌,建立了神经坏死病毒和鲨鱼弧菌的LAMP检测技术,分析了鱼养殖过程中细菌的变化规律,为合理科学地使用疫苗和免疫增强剂提供了依据。④研制出了2种免疫增强剂,半乳糖和配制的复合中草药对军曹鱼稚鱼不仅具有一定的促生长能力,而且能提高军曹鱼血清中的溶菌酶、超氧化物歧化酶活性,提高军曹鱼养殖过程中的成活率和产量。在国内率先对海水养殖鱼类疾病预防技术进行了集成,建立了以疫苗和免疫调节剂为基础的海水鱼类疾病预防技术体系,取得重大突破 ,技术水平达国际先进水平。 本项目取得丰硕的研究成果,包括发表论文46篇,其中SCI/EI收录7篇,获得授权发明专利2项。通过人员培训、技术推广与示范,从2006年开始,在在海南、阳江、汕头等地的部分鱼苗场、近300组养殖网箱中进行示范应用,取得了显着的经济和社会效益。

从日前召开的广东省科学技术奖励大会暨全省科技创新大会上获悉,中国水产科学研究院南海水产研究所主持承担的《南海主要海水养殖鱼类免疫机制及其在免疫防治中的应用》项目荣获2013年度广东省科学技术奖二等奖。该项目主要完成人为冯娟、邱丽华、郭志勋、苏友禄、徐力文、王瑞旋等。

发布时间:2008/7/18 10:40:07 来源: 编辑: 图片 1我来说两句 图片 2 中国水产门户网报道摘要:鱼用疫苗在提高动物体特异性免疫水平的同时亦能增强机体抗应激的能力,不污染环境,无药物残留。随着研究的不断深入,鱼用疫苗的种类愈来愈多。根据获得疫苗的不同方法,可将其分为死疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗等。鱼用疫苗的使用还有一系列问题尚未解决,如寻找保护性抗原,如何改进接种方式,如何将安全、经济、高效疫苗及时、大规模应用到养殖生产中等。
关键词:鱼用疫苗;研究进展;研究方向

《南海主要海水养殖鱼类免疫机制及其在免疫防治中的应用》项目从鱼及病原入手,通过对鱼免疫系统和病原的研究,研发了疫苗、病原检测和免疫增强剂技术并进行了集成,有效预防疾病的发生,取得重大突破,达到国际先进水平。其主要研究成果包括:

水产品营养丰富,味道鲜美,是人类重要的食品之一。然而,随着养殖业的发展,水域环境受到了较大的污染甚至恶化以及水产动物病害频发、暴发、并发和多发,这些都对水产养殖业造成了较大的威胁。如弧菌病是一种全球性的水产动物疾病,目前已发现的病原就有14种以上,其暴发性流行给水产养殖造成了巨大的经济损失;又如对虾病,目前已发现危害较严重的病毒就有10余种,加上细菌性、真菌性疾病,给对虾养殖业造成了较大的打击。据统计,韩国1996年水产养殖动物因病害所造成的死亡率为8.2%,但到2000年就增加到11.8%;我国水产养殖的病害发生形势也相当严峻,所发现的病害有300种以上,每年约有1/10的养殖面积受到损失,直接经济损失在百亿元以上。水产动物疾病的发生,已成为渔业发展的瓶颈。
目前,水产养殖病害防治主要有药物防治、生态预防和免疫预防等方法。虽然药物防治有方法简便、可控性好等优点,但潜在的风险也最大,药物残留问题引起的耐药性反应、变态反应、中毒反应等对环境、养殖动物以及养殖产品的食用者影响十分严重。微生态制剂不仅克服了动物体内有毒物质的积累,而且还提高了免疫力,但目前大多数微生态制剂还是为陆地动物设计的。与此相比,鱼用疫苗优势就十分显着,在提高动物体特异性免疫水平的同时亦能增强机体抗应激的能力;此外也符合不污染环境、水产食品无药物残留的要求。由此,采用鱼用疫苗预防水产动物疾病,越来越为各国的研究者所关注。1942年Duff将灭活的鲑鱼产气单胞菌口服免疫应用于硬头鳟,并获得成功。20世纪70年代中期,欧美等国开展鱼用疫苗的研制,1975年,美国疫苗有限公司获准生产商业性鱼用疫苗,开创了疫苗在鱼类应用上的新纪元。此后,许多人探索性地研究、制备疫苗,对那些突发而又难以用药物防治的鱼病进行免疫预防。本文将对国内外鱼用疫苗的研究进展和发展方向作有限的讨论。

1. 从免疫应激、免疫发育、分子生物学等层面对军曹鱼和海鲈的免疫机制进行了研究,建立了以机体的应答为标准来开发研究疫苗和免疫增强剂的新思路。

1鱼用疫苗的研究进展

2. 从病原生物学、环境微生态角度对军曹鱼和卵形鲳鲹的疾病发生进行了全面研究,并建立了2种病原菌的快速检测技术,为疾病的早期预防提供平台。

鱼用疫苗的发展相当迅速,几十年来,疫苗的种类日益增多,主要包括传统疫苗和新型疫苗2大类。

3. 根据各类免疫因子的应答模式及病原的特性,研究开发出1种美人鱼发光杆菌的LPS亚单位疫苗,1种神经坏死病毒的重组MCP基因工程疫苗和2种可应用于饲料的免疫调节剂,对病害进行立体的有效的预防。

1.1传统疫苗
传统疫苗即第1代疫苗,包括死疫苗和减毒疫苗。
1.1.1死疫苗死疫苗又称灭活疫苗,是将病原体扩大培养后,采用物理或化学方法在确保免疫原性不受影响的情况下灭活。该类疫苗具有安全性好、制备容易等特点,但是由于部分抗原成分被破坏,故存在免疫效果不理想、免疫力持久性差等问题。如鳗弧菌、鲑弧菌、吕氏耶尔森氏菌和杀鲜气单胞菌灭活疫苗的保护性免疫效果就非常出色。刘德福等采用草鱼病毒性出血病灭活疫苗对草鱼进行免疫注射,保护率达98%。
1.1.2减毒活疫苗这类疫苗是用活的变异弱毒病原体制成。接种后,它在鱼体内生长繁殖犹如发生了一次轻微的感染,所以获得的免疫力持久而坚强。因此为了增强免疫效果的持续性,更有效地诱导受免鱼的细胞免疫应答,研究和开发鱼用活疫苗是很有意义的。现在,应用基因操作技术可以将病原体上的目的抗原基因克隆到非致病性病毒或细菌中,从而令这种既带有目的抗原基因又没有致病性的微生物充当活疫苗的角色。防御病毒感染的抗原比较单纯,目的抗原的发现和克隆均较细菌简单,现在已有传染性造血组织坏死病毒减毒疫苗、疥疮病减毒菌苗、草鱼出血病细胞培养弱毒疫苗等几种疫苗的研究取得了实质性的进展。然而长期以来,为了避免用于制备活疫苗的病原菌在水体中扩散和毒力回归的危险,各国均不敢使用鱼用活疫苗。

4.在国内率先对海水养殖鱼类疾病预防技术进行了集成,建立了以疫苗和免疫调节剂为基础的海水鱼类疾病预防技术体系,取得重大突破。该技术在海南省、广东省等7个地区的鱼苗场及养殖网箱进行了应用,取得了显着的经济效益和社会效益。

1.2新型疫苗
随着分子生物学和基因工程技术的不断发展,20世纪90年代又出现了新型的鱼用疫苗,主要包括亚单位疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗等。
1.2.1亚单位疫苗多糖、蛋白质偶联的亚单位疫苗是国外1980年代发展起来的新一代疫苗。与传统疫苗相比,亚单位疫苗有抗体出现早、滴度高、持续时间长等优点;而且它具有胸腺依赖性免疫原的性质。其特点是:能激发T辅助细胞和形成T记忆细胞,重复接种能产生记忆性免疫增强效应,抗体水平可呈几何级数增长;有些细菌毒素与多糖偶联后,不仅免疫原性得到很好保留,而且毒性显着下降;偶联苗具有载体蛋白效应。在水产动物疾病防治领域,有不少研究人员从事该疫苗的研究。如LinJH等对一种Anemianauplii的亚单位疫苗进行了研究,并取得一定进展。不过,由于种种原因,许多防治水产动物疾病的亚单位疫苗都处于实验室阶段,应用实践的较少。
1.2.2DNA疫苗最近引起人们高度重视的还有DNA疫苗,是继减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗和重组多肽疫苗之后的又一新型疫苗。这种疫苗是含有编码抗原基因的真核表达质粒DNA,经直接接种体内后,可被宿主细胞摄取,并转录、翻译、表达出相应的抗原,然后通过不同途径刺激机体产生针对此种抗原的免疫应答。与常规基因重组疫苗相比,DNA疫苗有以下优点:具有高效性,DNA疫苗以10~100g/尾的剂量免疫即可得到良好的免疫效果;由于质粒本身具有佐剂的功效,因此使用DNA疫苗免疫接种时不用加佐剂。目前,对鱼用DNA疫苗的应用研究主要集中在对鲑、鳟的IHNV、VHSV、鲤春病毒等传染性病毒的防治上。Lorenzen等针对VHSV糖蛋白构建的DNA疫苗,能诱导70%的虹鳟产生较高水平的免疫保护。加拿大研究的一种可以防治IHN的DNA疫苗,目前正在试验研究阶段。然而,Lorenzen等指出,从长远来看,鱼用DNA疫苗在作用过程中对环境会产生一定负面影响,而且DNA疫苗的接种多采用肌肉注射,耗时费力,在实际生产中不易应用。所以,尽快完善DNA疫苗,开发针对主要致病性细菌的多联基因工程疫苗就显得极为迫切。
1.2.3合成肽疫苗合成肽疫苗是用化学合成法人工合成病原微生物的保护性多肽并将其连接到大分子载体上,再加入佐剂制成的疫苗,具有制备容易、可大量生产、稳定、易保存、副反应少、价廉及使用安全等优点,因此有人认为合成肽疫苗是疫苗学的最终目标,非常适于传统疫苗所不能达到的特殊目的。合成肽疫苗近几年也已得到发展,但还存在不少理论和实际上的障碍,研究基本上处于实验阶段,其具体的作用机制、免疫途径以及免疫效果等都有待进一步研究。

5. 获得国家发明专利授权2项,发表论文48篇,其中SCI期刊收录7篇;培养硕士研究生6名,博士研究生1名;举办各类培训班16次,培训专业技术人员和养殖户658人次。

2鱼用疫苗的研究方向

2.1寻找免疫保护性抗原
用福尔马林灭活的菌体免疫后,产生针对全菌体各类抗原成分的免疫应答,然而,菌体粗提出的LPS的免疫效果与全菌体苗相比并无差异,甚至有的LPS比全菌体的免疫效果更好。因此,寻找免疫保护性抗原并制备出更好的重组亚单位疫苗很有价值。目前,对多种病原的膜蛋白、菌体内外毒素、蛋白酶、核糖体等成分的免疫效果研究显示,ERM鲁氏耶尔森疫苗和弧菌病的LPS是免疫保护性抗原;IHN的结构蛋白、VHS的囊膜糖蛋白是免疫保护性抗原。今后这类研究势必会加强。

2.2寻找有效、方便的接种途径
不同于人、兽用疫苗,鱼用疫苗的给予途径较为复杂,寻找有效、方便的接种途径更为重要。目前鱼用疫苗的给予方式主要有以下几种:注射、口服、浸浴或喷雾。
长期以来人们认为采用注射法费时费力而且又会对受体鱼造成很强的应激性刺激,所以受到较大的限制。然而自从欧洲的研究者们证明了在鱼用疫苗中添加佐剂并且以注射法接种能显着提高受免鱼的免疫效果以来,随着连续注射法的改进和鱼群疫苗自动注射机的研发成功,已经在很大程度上改变了人们对注射法在鱼类免疫接种中应用的看法。在日本,对已证明只有采用注射接种才能获得较好免疫效果的龟用疫苗,如彩虹病毒疫苗、链球菌症疫苗和类结症疫苗等,都采用注射法接种。然而,已有报道指出,注射添加了佐剂的疫苗可能造成受体鱼的注射部位腹腔膜与内脏的粘结;疫苗自动注射机也还存在“误注射”等问题。
此外,作用于鱼体外部的浸浴也是目前常使用的一种给予途径,特别适用于大量小规格鱼种的免疫接种。但是如何使疫苗大量进入鱼体内则是浸泡法应该解决的问题。近期,欧洲有人报道了2次浸泡法能提高鱼用疫苗的免疫效果;日本人通过浸泡数次也证明了能提高五条鰤(Seriolaquinqueradiata)类结症疫苗的免疫效果,但又遭遇到由于成本较高而不能应用于生产的困扰。
口服是一种方便的途径,不受时间、地点和鱼体大小限制,可减少劳动强度和减少因水产动物的应激所带来的不良反应。丁诗华等以草鱼为试验动物对嗜水气单胞菌口服疫苗的免疫效果进行测定,并已取得阶段性成果。英国水产养殖疫苗有限公司已开发出AquaVac抗弧菌口服疫苗和AquaVacERM口服疫苗。为了避免疫苗的抗原性受到破坏,包被疫苗、将疫苗与中和剂等一起投喂等方法是值得研究的。然而,由于口服疫苗对于一些通过嗅觉觅食的鱼类来说效果并不理想,所以,口服疫苗在实践运用中也存在着一定的局限性。

2.3疫苗免疫效果的判定
为了测定免疫接种后受免鱼的免疫应答水平,除采用活菌攻毒试验外,还有多种方法可供采用。对于结构较为单纯的病毒性疫苗,测定受免鱼血清中的中和抗体,就可较为准确地评价受免鱼体的免疫防御水平。但是,对于采用致病机制和结构均比较复杂的细菌性疫苗,仅检测1项或者2项指标是很难对受免鱼的免疫防御水平作出准确评价的。这是因为研究者虽然可以通过检测针对菌体外毒素的血清中的中和效价和针对菌体表面抗原的血清中的调理抗体效价以及测定巨噬细胞的特异性吞噬率、自然杀伤细胞的杀菌活性和嗜中性白细胞中活性氧的浓度等,作为评价受免鱼免疫应答水平的指标。但是,在接受抗原刺激后受免鱼的免疫应答是十分复杂的生理学过程,是在各种免疫细胞及其多种细胞因子的协同作用下完成的,因此,凭1~2项指标不可能全面反映出这种复杂的免疫应答状况。不过,通过检测上述指标可以比较受免鱼某种特异性或者非特异性免疫应答的上升程度。为了准确评价鱼用疫苗的效果,除了要进行攻毒试验外,还有必要结合疫苗在野外鱼池中应用的效果和各项免疫指标进行综合分析。

2.4改善养殖环境以增强鱼用疫苗的免疫效果
即使有了免疫效果良好的疫苗,如果应用于处于恶劣养殖环境中的鱼类,也是不可能成功的诱导受免鱼类产生高水平免疫应答的。在鱼用疫苗的应用过程中,那些影响疫苗效果的环境因素是很多的,其中一些还尚未受到重视,如养殖密度的影响、鱼用药物对鱼类免疫应答的影响,将某些化学和抗生素类渔用药物与疫苗同时使用的做法也是欠妥当的。

2.5加快鱼用疫苗的中试试验基地的建设
中试试验基地是连接实验室和生产应用的重要桥梁,也是鱼用疫苗再研究的一个重要场地。商品性鱼用疫苗难于应市,其关键之一就是缺乏中试试验基地。实验室所研究的疫苗,是否能真正阻止传染性疾病的流行,是否真正能在生产上使用,还需要中试试验基地的进一步研究和验证。

2.6仔、幼鱼的免疫
各种海水鱼的病毒性中枢神经坏死症和鲑科鱼类的传染性造血器官坏死症等都能危害孵化后的仔、幼鱼,并造成极大的损失。然而,以往开展的鱼类免疫研究,都是针对鱼类的特异性免疫机制,通过接种疫苗而提高受免鱼的免疫力的。但是,一般而言,刚孵化出来的仔、幼鱼的特异性免疫系统尚未完善,仔、幼鱼的细胞免疫机制需要在孵出2周后建立,而体液免疫机制则需要在4~6周才能建立;而且仔幼鱼的体液免疫应答能力较成鱼更低,免疫力持续时间也较短。因此,鱼类自孵化后到特异性免疫机制形成之前的~段时间内需要依靠被动免疫。
对仔、幼鱼接种疫苗时,必须要注意的问题就是要避免引起鱼体产生免疫耐受。这是因为处于早期发育阶段的仔幼鱼的免疫系统尚未完全形成,不仅不可能对抗原性物质产生特异性免疫应答,而且由于机体尚处于不能识别自我与非我的阶段,因而就可能诱导其产生免疫耐受,即使在其免疫系统完善后也不能对这种抗原产生免疫应答了,结果是对相应的病原体的入侵失去防御反应。因此,为了避免因免疫接种诱导的免疫耐受现象,有必要对各种鱼类的仔幼鱼时期免疫系统的形态和机制进行深入了解。

3鱼用疫苗的前景

在近几十年的研究与推广应用中,我国在海水养殖生物的疾病防治技术方面取得了长足的进展。随着鱼用疫苗种类的日益多样化,养殖鱼类的疾病防治逐步转向以免疫为主、使用抗生素为辅。由于鱼用疫苗具有使用后无污染、在鱼体内无残留、不会对鱼体产生耐药性等诸多优点,使得鱼用疫苗在水产动物疾病防治上的不可替代性得以展现。但是,也应看到在鱼用疫苗的使用过程中还有一系列问题尚未解决,比如寻找保护性抗原,如何改进接种方式,如何将安全、经济、高效疫苗及时、大规模应用到养殖生产中等。尽快解决这些难题,不断完善渔用疫苗,才能使水产养殖产业的发展步伐不断加快。

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